Dans le film, Mario et Luigi réparent une conduite d'eau souterraine à Brooklyn. Au cours de cette intervention, Mario et son frère Luigi se retrouvent dans une mystérieuse canalisation qui les transporte dans un nouveau monde magique. Les frères se retrouvent séparés et c'est à Mario de retrouver Luigi. Avec l'aide de Toad, un résident du Royaume des Champignons, et de la Princesse Peach qui règne sur le Royaume des Champignons, Mario découvre ses propres pouvoirs et se lance à la recherche de son frère. Dans l’entre temps, Bowser rallie ses troupes et se lance à l’assaut du Royaume des Champignons pour le détruire. Mario réussira-t-il à sauver son frère et les habitants du Royaume des Champignons ?
Les principaux caractères de ce film d’animation sont interprétés par de grands noms tels que : Chris Pratt (Mario), Charlie Day (Luigi), Anya Taylor-Joy (Princess Peach), Jack Black (Bowser), Keegan-Michael Key (Toad) et Seth Rogan (Donkey Kong).
